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ELISA試劑盒常見問答
涉及說明書操作內(nèi)容以2019年版說明書為準(zhǔn)。
1、問：牛免疫球蛋白G（IgG）ELISA Kit
購(gòu)買試劑盒目的是為了檢測(cè)區(qū)分牛血清是否是從吃過奶的牛的采集。胎牛、新生牛和小牛的IgG范圍，有相關(guān)數(shù)據(jù)嗎？
答：
胎牛血清IgG：38.3±16.2μg/ml
小牛血清IgG：8.6±2.5mg/ml
新生牛血清IgG：16.8±4.1mg/ml
注意：
1）后面單位，胎牛免疫球蛋白G（IgG）很少的
2）圖片產(chǎn)品非實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中牛免疫球蛋白G（IgG）實(shí)驗(yàn)對(duì)象
2、問：看說明書里，如果樣本濃度高，可以不用稀釋，直接加原液。這個(gè)直接加血清原液，你們自己親自做過嗎？因?yàn)橹拔覀冇脛e家的，他們說明書里，加樣是：10微升樣品加40微升樣品稀釋液。咨詢他們?nèi)绻绻麧舛雀?，可以加原液?jiǎn)幔克麄冋f可以，可能他們沒做過，說可以。可我們做了，不可以。問他們，又說是可能離子濃度不夠。
答：ELISA試劑盒檢測(cè)范圍是固定的，樣本是否稀釋是根據(jù)樣本實(shí)際濃度來選擇的，但前提條件樣本要落在檢測(cè)范圍內(nèi)，濃度高于檢測(cè)范圍，稀釋樣本達(dá)到檢測(cè)范圍內(nèi)，濃度低于檢測(cè)范圍，那這個(gè)試劑盒靈敏度是不夠的。離子濃度跟樣本濃度沒有關(guān)聯(lián)不是影響ELISA試劑盒檢測(cè)的關(guān)鍵。
3、問：雙抗夾心法中，最后TMB用硫酸終止，測(cè)量OD450的時(shí)候是用單波長(zhǎng)450nm還是雙波長(zhǎng)測(cè)量？如果是后者，參考波長(zhǎng)是哪個(gè)？630nm可以嗎？
▲圖片來源網(wǎng)絡(luò)
答：如果有條件的話，就用雙波長(zhǎng)450nm，630nm。如果沒有，單波長(zhǎng)也可以。
4、問：牛免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（ELISA）樣本PH值對(duì)這個(gè)指標(biāo)影響大嗎？
▲圖片來源網(wǎng)絡(luò)
答：有，要保持中性。不要太偏酸和太偏堿。規(guī)定最佳PH=7.2-7.4，可耐受PH5.0-9.0，此外PH值都不適用。
5、問：樣本PH值偏小，用氫氧化鈉調(diào)PH值合適嗎？
答：合適，而且必須調(diào)！我們之前做的靜脈注射免疫球蛋白PH=4，都是要調(diào)PH到中性。然后再測(cè)定。
6、問：
小鼠白細(xì)胞介素-12（IL-12 P35）ELISA Kit
小鼠白細(xì)胞介素-12（IL-12 P40）ELISA Kit
小鼠白細(xì)胞介素-12（IL-12 P70）ELISA Kit
三個(gè)指標(biāo)有什么區(qū)別和聯(lián)系？
答：完整的IL-12由兩條鏈通過二硫鍵相連，稱為P70，而這兩條鏈分別稱為P35和P40。
IL-12是一由p35和p40（IL-12β）兩條鏈組成的異源二聚體，兩個(gè)亞單位通過二硫鍵連接在一起，這種結(jié)構(gòu)在已發(fā)現(xiàn)的IL中所罕見。通常情況下，p40的量遠(yuǎn)超出p70，在鼠中已觀察到p40同源二聚體的產(chǎn)生，是由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌的，p40同源二聚體沒有生物學(xué)活性，但它能和IL-12Rβ結(jié)合，與p70競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪IL-12受體（IL-12R）而拮抗其生物學(xué)作用。單獨(dú)的p35不具有生物學(xué)活性，但卻是合成p70的限速因子。
-----來源于百度百科
天然IL-12（p70 ）具有獨(dú)特的異源二聚體結(jié)構(gòu),是由p40 和 p35兩個(gè)亞基通過二硫鍵共價(jià)連接而成的糖基化肽鏈〔相對(duì)分子質(zhì)量為(70～75)×103〕.IL-12 p35和p40基因定位于不同的染色體,各自受不同的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)節(jié),按需生成有活性的p70或拮抗性p(40)2及單體p40.活性形式的IL-12 p70需要兩條亞基共同表達(dá),并以1∶1形式進(jìn)行自然組合.對(duì)已報(bào)道的IL-12基因載體來說,存在p40和p35不匹配的組合形式〔5-7〕.構(gòu)建rhscIL-12融合基因,可使其在一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下,翻譯表達(dá)活性蛋白,保證p40和p35以1∶1比例形成單鏈異二聚體。
白介素-12是p70,p40是其中的一個(gè)亞基。
7、問：?jiǎn)魏司奘杉?xì)胞的趨化因子有哪些？
答：CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17和CCL22
固體樣本處理問題
1、組織樣本操作流程：
1）組織樣本必須保持鮮重，如果是凍存的組織，應(yīng)該室溫平行2小時(shí)以上，然后用生理鹽水沖洗干凈，再用濾紙把周圍的水分吸干，稱重！組織重量不能低于50mg。
2）組織勻漿液選取是PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）勻漿的比例為1:10，相當(dāng)于1g組織加9ml的勻漿液。
3）組織勻漿后，離心取上清，離心轉(zhuǎn)數(shù)為5000轉(zhuǎn)，但不能超過5000轉(zhuǎn)，時(shí)間為15分鐘。
4）實(shí)驗(yàn)中老師樣本提取的是200mg的樣本加1.8ml的勻漿液。
2、土壤樣本處理方式
土壤樣本處理一般分為2個(gè)步驟，第一個(gè)步驟是測(cè)定含水率，第二個(gè)步驟是進(jìn)行勻漿，按照10%混勻離心取上清待檢。具體操作如下。
第一部分：
1）稱取土壤500mg左右，必須保持鮮重，按照重量和體積比加入1:10的PBS溶液（PBS的濃度為0.01mol/L,PH控制在7.2-7.4），例如稱取的是0.5g加入5ml的PBS，稱取的重量不要求保持一致，但勻漿的比例都是按照1:10的關(guān)系來。
2）進(jìn)行渦旋震蕩，充分混勻，渦旋時(shí)間30秒。
3）離心取上清，離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)每分，時(shí)間為15分鐘左右，取上清液待檢。
第二部分：
稱取500mg左右的樣本，進(jìn)行烘干，前后稱取重量，測(cè)定含水率。（這個(gè)是為后期剔除掉含水率）
3、糞便處理（免疫學(xué)）
1）稱取樣本中的重量不小于50mg，一般以1g為基準(zhǔn),但不嚴(yán)格要求固定樣本每個(gè)重量必須達(dá)到相同的水平。
2）勻漿的比例選取10%，相當(dāng)于1g糞便加9ml的勻漿液來進(jìn)行勻漿。
3）勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。
4）離心取上清，離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)每分，時(shí)間是15分鐘。取上清液待檢！
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